吉安安福红豆杉附生铁皮石斛为例多糖的讨论

铁皮石斛属 ( Dendrobium)植物,是集观赏和药用价值为 一体的药用植物,为兰科中的第二大属,全球目前已经发现约有存在1400 余种。

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铁皮石斛广泛分布于亚洲、欧洲及大洋洲等热带及亚热带地区,其中我国约有80多种,主要分布于西南、华东 及华南地区。在我国传统医学理论与古籍医学中多有记载。其多种石斛属植物的新鲜或干燥茎被收作药用,统称石斛 ( herba dendrobe) 。

石斛为常用贵重药材,它具有滋阴清热、 益胃生津、润肺止咳等功效。几十年来,中外学者对石斛属植物的化学成分和药理作用进行了大量研究,发现石斛属植物化学成分具有多种多样,其主要有效 成分为石斛类多糖和其生物碱,另外还有酚类、菲类、 芪类、倍半萜类及香豆素等成分。

近年来,对于吉安安福石斛多糖应有良好的临床实际效果,因此逐渐引起人们的重视,与之相关的研究工作也逐渐展开起来。目前相关的研究工作主要集中在对于石斛多糖的结构分析、功能作用和分离提取等方 面,这些研究工作为后续的进一步地深入研究和产业化应用奠定了前期的基础,但仍然有许多科学基础层面的研究和技术层面的开发还有待于进一步地深入开展。

下面,我们通过本文就近些年来国内外对石斛多糖方面的研究进展进行了部分的梳理与小结,主要是对多糖的部分进行解读,为大家的合理使用提供帮助。

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石斛多糖

石斛多糖广泛的存在与石斛的各科属的植物中,相对其它的成分,石斛多糖的含量是高的。也是主要的功效成分之一。

石斛多糖的结构

目前国内外的研究者对石斛多糖的结构分析工作主要有以下几个方面: 构成多糖的单糖、确定多糖的分子量范围、 单糖的连接点及形式、单糖和糖苷键的类型、相关的重复单位等研究点。

石斛多糖的单糖组成

石斛多糖主要由葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖 及甘露糖等单糖组成,由于不同石斛种属间还是存在差异的,所以不同石斛间多糖的单糖组分和含量也不尽相同。 有研究资料发现与表明,铁皮石斛中的多糖主要由D-木糖、L-阿拉伯糖和D-葡萄糖组成。

有学者对六种石斛所含的水溶性多糖中各单糖的比例研究发现,不同石斛多糖所含的单糖种类和比例也是均有不同。

学者华允芬等详细比较了细茎石斛、细叶石斛、铁皮石斛这三种石斛的水溶性多糖中的中性糖、糖醛酸以及蛋白质质量分数,结果发现3 种石斛都以中性糖为主,3 种石斛相比,细茎石斛含的中性

糖最多,细叶石斛含糖醛酸和蛋白质最多。

另有学者罗傲雪等从金钗石斛中分离出 DNP1-1、 DNP2-1、 DNP3-1、DNP4-2四个多糖,经过单糖分析其主要成分为甘露糖、葡萄糖、半乳糖和少量鼠李糖、树胶醛糖和木糖。

学者查学强等从霍山石斛中分离得到多糖HPS-1B23,通过化学方法和NMR技术研究表明,此多糖由葡萄糖、甘露糖和半乳糖组成,各单糖摩尔比为:31:10:8。

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石斛多糖分子量的确定

石斛多糖在一定分子量范围内,但是也不一定为单一组分的物质,而应该是一定分子量分布的混合物。 有研究者运用糖组成分析、甲基化分析及NMR等方法分析铁皮石斛中提取的 DT2和DT3两种多糖,发现DT2和DT3 的平均相对分子量分别为7.4 x105u和5.4 x105u,且主要含有葡萄糖、半乳糖、木糖及少量阿拉伯糖和甘露糖, 各单糖摩尔比分别为5.9 : 1.0 : 1.0 : 0.8:0.5 和 7.9:1.3:1.0:0.5:0.7。

学者罗傲雪等将金钗石斛粗多糖经DEAE纤维素柱和 Sephadex G-200凝胶渗透色 谱柱进行纯化,分别得到DNP1-1,DNP2-1, DNP3-1, DNP4-2 四个多糖, 并通过凝胶色谱分析得出 DNP1-1、DNP2-1、DNP3-1、DNP4-2 的平均相对分子量分别为 136、27.7、11.8、11.4ku。

学者何铁光等从 铁皮石斛原球茎中分离得到灰色多糖DCPP3c-l,经化学方法分析, 发现DCPP3c-1 为均一组分, 相对分子质量为 72.4ku, 由甘露糖、 鼠李糖、 半乳糖醛酸、 葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成, 其分子物质的量之比为 1.1204:1.000:1.046:23.354:3.828:1.046。

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单糖的连接点形式及糖苷键类型

有研究学者从金钗石斛中分离出果胶多糖 DNP-W5, 其主要成分为甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖及半乳糖醛酸,其摩尔比为3.1:8.1:8.2:0.6:4.2:3.9,其半乳糖醛酸中有21%以甲酯形式存在,且乙酰基含量达到6.9%。

研究发现多糖DNP-W5以【双糖-a- GalAp-(1 —2 ) – a-Rhap- 1f】为主体,其侧链在 O-4、O-3 位分别为 Rhap和GalpA, 侧链由半乳糖基、甘露糖基、葡糖基和木糖基组成。

学者杨虹等运用糖组成分析、甲基化分析及 NMR 等方法分析铁皮石斛中提取的 DT2 和 DT3 两种多糖, 发现 DT2 和 DT3主要由a-(1 —4)糖苷键-D-Glu缩合而成,两者的差别主要在于支链的长短和连接位置的不尽相同。对铁皮石斛粗多糖DOP进行了分离纯化及UV、 IR分析,初步鉴定5个酸性糖均为含p-D-甘露糖 基的蛋白聚糖,其糖环构型为吡喃型。

学者陈云龙等从细茎石斛中提取分离得到8 种水溶性多糖。 对分离得到的主要多糖进行组成结构分析, 发现该8 种多糖都为均 一多糖: DMP1a- 1、 DMP1a-2、DMP2a-l、DMP3a-1、DMP4a-1、DMP5a-1、 DMP6a-1 和 DMP7a-1。 其中DMPla-1 的相对分子 质量为 28ku, 葡萄糖、甘露糖组成摩尔比为1:4.798, 分子中 1-3,1-4( 或1-2) ,1-6 连接的糖苷键数比为 8.75:23(59):1,红外光谱数据显示其为p-D-吡喃甘 露聚糖。

学者王世林等从铁皮石斛中分离纯化得到3 种多糖,确定它们为一类O-乙酰葡萄甘露聚糖,由几个 p- (1—3)-甘露吡喃糖基和一个p-(1 —4) -D-吡 喃糖基重复构成主链,支链可能由 p-( 1—4) -葡萄 糖基和其他戊糖基组成,并连接在上链葡萄糖基的3 或 6 位 。

学者何铁光等从铁皮石斛原球茎粗多糖( DCPP) 分离纯化得到灰色  多糖 DCPP3c-l。 其纯度经比旋 光度法、柱层析、 紫外扫描检测,组分和结构经薄层层析、高效液相色谱、红外光谱及高碘酸钠氧化等实验分析,结果显示分子中 1—6 残基占14%,1—2 或 1—4 残基占40.7%,1—3 键占45.3%。 红外光谱显示其具有多糖特征吸收峰,并存在a-吡喃糖苷键。 1.4 重复单位。

有资料表明将江西安福的寄生在红豆杉上的石斛进行研究,发行其多糖经过 DEAE 阴离子纤维素柱和凝胶渗透色谱( 包括 Sephacryl S-200 和 Sephadex G-75/G-100) 得到多糖 HPS-1B23。 在过碘酸氧 化基础上进行 smith 降解,甲基化分析和部分酸水解后,得到了 HPS-1B23 多糖的重复单位如图1 所示。

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石斛多糖的提取与加工工艺

国内外对于石斛多糖的研究中,石斛多糖的提取方法以水提醇沉法为主,还有酶法提取和超声波 辅助提取等方法。

铁皮石斛的水提醇沉法

水提醇沉法是多糖提取的经典方法,主要是利用多糖能溶于水不能溶于乙醇的特性,在众多石斛多糖的研究中采用较为方便简单的水提醇沉法。

学者罗傲雪等以苯酚-硫酸比色法测定的多糖含量为指标,优化了迭鞘石斛( D.denneanum) 多糖的提取工艺同。得到最佳提取工艺为:300mL水(1.000g石斛粉末) ,回流 3 次,每次 1.5h。 并通过实验证明了加水量、回流时间、回流次数均对样品多糖的提取率有显著影响,其影响的程度依次为回流次数 >回流 时间 >加水量。

学者钱叶等盹采用紫外分光光度法测定多糖含量,结果表明影响石斛多糖含量的因素依次 为粉碎度 >提取次数 >加水量 >提取时间。综合考 虑各因素,确定石斛中石斛多糖的最佳提取条件为: 将药材粉碎至粗粉,加水 20 倍量,提取 4 次,每 次 8h。

学者熊丽萍等对水煎法提取石斛中的石斛多糖工艺进行了优选,确定石斛多糖的较佳提取工艺条件为:5.0g石斛粉末,用20倍重量的水,在50度的水浴中加热提取3 次,每次 1h。 研究还得出以下结论,各因子对提取效果的影响大小顺序是:溶剂用量 >提取 次数 >提取温度 >提取时间;

几种石斛的多糖含量大小顺序为:黄花石斛 >紫皮石斛 >水兰石斛 >细茎石斛 >软脚铁皮 >紫皮兰 >金钗石斛。

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铁皮石斛的酶法提取

传统的水提醇沉法步骤繁多,大大影响了多糖的提取率,近年来,不少学者开始利用酶法来提取石斛多糖,利用酶水解细胞壁,促进多糖物质的溶出,进而以期提高其得率。

学者张萍等采用酶法测定铁皮石斛中多糖的含量,最佳工艺条件为:酶解时间2h,酶解温度40度,纤维素酶用量20% ,PH=6.0。实验还与水煎法进行了比较,结果显示酶法能提高多糖的提取率和多糖的含量。

学者尚喜雨分别以水提法和酶法提取铁皮石斛中的石斛多糖,水提法在最佳条件下多糖的平均提取率为12.07%;酶法提取的最佳条件为:4%的酶量,在 40度水温和pH为6的环境下酶解3h,多糖的提取率为26.49% ,比水提法提高了 119%。

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超声波辅助提取

利用超声波能促进植物的多糖的溶出是近代相对流行的方法,有研究学者将其作为一种预处理的方法应用在石斛多糖的提取中。

学者罗傲雪等通过优选超声波辅助热回流法提取马鞭石斛多糖。 结果显示,最优工艺条件为:温度 95度,时间16min,提取4次。采用此工艺,马鞭石斛多糖提取率为( 18.64 ±0.396) % ,显著高于传统热回流法的提取率。 并指出该工艺具有良好的精密度和稳定性,重复性好,适用于马鞭石斛多糖的提取。(文:熊学敏)

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